CLONACIÓN DEL GEN DE LA INSULINA HUMANA.

La insulina es una hormona de composición proteica que secretan las células beta del páncreas. El gen INS, que se encuentra en el cromosoma 11 humano, se encarga de codificar las instrucciones para sintetizar la proteína precursora de la insulina. Este gen codifica para la proinsulina, un precursor de la insulina. Para que la proinsulina se convierta en insulina, debe sufrir ciertas modificaciones en el aparato de Golgi de las células beta.

En este protocolo, se explican todos los pasos que hay que seguir para amplificar tu propio gen de la insulina en la parte codificante para detectar mi variante (si en ella hay mutaciones, SNPs, etc).

Asimismo, hay que señalar que, para extraer el gen que codifica la insulina humana, necesitamos aislar el ácido nucleico que codifica para esta proteína. Siguiendo la lógica, extraeremos DNA a partir de sangre, ya que el RNA que sintetiza la insulina se encuentra en el páncreas y, para extraerlo, habría que realizar una operación.

Como consideración inicial tomaremos que nada del material utilizado ha podido pasar por el autoclave ya que, de ser así, este podría haber sido contaminado con microorganismos presentes en el mismo. 

PASOS PARA CLONAR NUESTRO GEN DE LA INSULINA

1.    AISLAMIENTO DE DNA.

En primer lugar, debemos obtener la muestra de DNA mediante una extracción de sangre. A continuación, se muestra un vídeo de cómo podemos llevarlo a cabo. 

Una vez tenemos la muestra, debemos aislar los glóbulos blancos (ya que son las únicas células nucleadas de la sangre) mediante centrifugación y, posteriormente, purificar el DNA. Para ello, vamos a utilizar un kit barato y de fácil uso:  el minikit de DNA genómico PureLink™, que contiene suficientes reactivos para 50 preparaciones de DNA. Si clicamos en el enlace anterior, podremos observar el protocolo de cómo llevarlo a cabo. Por si es de ayuda, se adjunta un vídeo para facilitar el aislamiento con el mismo kit que el anteriormente indicado. El precio de este kit para 50 preparaciones es de 205 euros, por lo que cada preparación supondría 41 euros.

2.    BÚSQUEDA DEL GEN EN UNA BASE DE DATOS.

Una vez aislado el DNA, vamos a buscar el gen de la insulina en una base de datos para, posteriormente, poder llevar a cabo la PCR. En nuestro caso, haremos uso de la web NCBI, concretamente en la sección “Nucleotide”, para ello. Se tendrá en cuenta la región CDS, la cual representa la secuencia del gen que se transcribirá y, por lo tanto, la que interesará amplificar.

El gen de la insulina humana presenta 4969pb, donde hay 2 exones: exón 1 (2424 – 2610) y exón 2 (3397 – 3542). En total, el gen que queremos amplificar tendría 1.119 pb.

3.    ESTRATEGIA DE SECUENCIACIÓN Y DISEÑO DE CEBADORES. 

Para llevar a cabo la secuenciación de estos genes, realizaremos el método Sanger, basado en el proceso de replicación del DNA. Sin embargo, el propio método Sanger posee una serie de limitaciones. La principal, y la que tendremos en cuenta, es que solo puede secuenciar secuencias de entre 600 y 700pb. 

Como hemos indicado anteriormente, el gen de la insulina humana tiene 1.119pb, por lo que deberíamos usar 2 primers (en total habrá 4, 2 forward y 2 reverse). Gracias a la opción de "Pick primers" de la web NCBI, podremos elegir el tamaño y características de los mismos.  Principalmente, la estrategia llevada a cabo para diseñar los primers ha sido basada en la Tm. Asimismo, hemos restringido de entrada el origen y el fin de nuestros cebadores. Tras probar en numerosas ocasiones, considero que estos primers serían aceptables  para realizar PCR. 

Habrá que tener en cuenta características como:

• Afinidad por otros sitios de unión.  Debe tenerse en cuenta que los cebadores pueden tener afinidad por otros sitios de unión dentro de la secuencia que se está amplificando. Por lo tanto, si los cebadores diseñados exhiben esta característica, prefiera aquellos con más errores en el extremo 3' de la secuencia que en el extremo 5'. Esto se debe a que la polimerasa Taq participa en la amplificación de la secuencia de nucleótidos desde el extremo 3'. Por lo tanto, si se encuentra el extremo 3' equivocado, su asociación y su amplificación se vuelven más complicadas. Esto evita que se amplifiquen valores extremos no deseados.

• Temperatura de fusión (Tm).  La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que se separa el 50% de las cadenas de DNA (desnaturalización del DNA). El cálculo de las Tm de los oligos lo he realizado gracias a la página web OligoCalc. La temperatura de fusión determina el diseño del cebador y la diferencia entre la Tm del cebador y la Tm del DNA. Si la diferencia de Tm es de 15-20ºC se nota que los primers compiten con el producto (DNA) y el producto no pega. Por lo tanto, es necesario calcular la Tm del DNA antes de comenzar el diseño del cebador.

Los primers elegidos se encuentran a continuación:

Como la región codificante CDS 1 tiene una Tm de 78,3ºC, pondremos como Tm óptima 63.3ºC (15ºC menos, para hacer el cebador más competitivo). En cuanto a las restricciones, impondremos que el forward vaya de 2300 a 2424 y el reverse desde 2610 hasta 2720. 

• Primer 1 forward: TCGTGAAGCATGTGGGGGT (se encuentra entre la base 2323 y la 2341 de la cadena plus).
• Primer 1 reverse: CAATGGGCGGTTGGTCA (esta secuencia es el reverso complementario y se encuentra entre la base 2629 y 2612 de la cadena minus).

Genera un producto de 307 nucleótidos de longitud. Hemos elegido este primer porque presenta una Tm muy cercana entre ambos cebadores (61.53 y 60.68ºC, respectivamente) y, además, de entre todas las opciones posibles, presenta el menor nivel de autocomplementariedad. 

Como la región codificante CDS 2 tiene una Tm de 82,5ºC, pondremos como Tm óptima 67,5ºC. En cuanto a las restricciones, impondremos que el forward vaya de 3297 a 3397 y el reverse desde 3542 hasta 3642. 

• Primer 2 forward: TCCTCCTGTGTCCCTCTGCCTCG (se encuentra entre la base 3333 y la 3355). 
• Primer 2 reverse:  AGCAGGGCTGGTTCAAGGGCTTT (esta secuencia es el reverso complementario y s encuentra entre la base 3621 y la 3599 de la cadena minus).

Genera un producto de 289 nucleótidos de longitud. Hemos elegido este primer porque presenta una Tm muy cercana entre ambos cebadores (67.36 y 67.02ºC, respectivamente) y, además, de entre todas las opciones posibles, presenta el menor nivel de autocomplementariedad. 

Tras diseñar los cebadores, realizamos el pedido de los mismos. Encargaremos los cebadores de ThermoFisher que, como cada bote de 25nmol cuesta 5 euros y necesitamos 4, tendremos que pagar 20 euros. 

Nota: como normalmente la cantidad de cebador que nos llega no es exacta, debemos medirla haciendo uso de Nanodrop (explicación de cómo usarlo en el vídeo adjunto). 

4.    AMPLIFICACIÓN DEL DNA POR PCR. 

Dado que hay dos exones diferentes, debemos tener en cuenta que cada CDS se amplifica por separado, es decir, en diferentes reacciones de PCR. Sin embargo, al tratarse del mismo método para ambos, solo se describirá el proceso de amplificación de DNA por PCR una vez (para el CDS 1), es aplicable para CDS 2. 

La amplificación de DNA por PCR se basa en la reacción en cadena de la polimerasa. Para ello, también se sigue un protocolo y, en este caso, haremos la PCR haciendo uso de Thermo Scientific Taq DNA Polymerase with KCl Buffer, cuyo precio para 4 unidades es de 21,36 euros. Por tanto, cada PCR costaría 5,34 euros. Este kit contiene lo siguiente:

Sin embargo, debería, además, comprar los siguientes elementos no proporcionados por el kit:

• dNTP Mix (20mM). El precio para 4x5mL sería de 1.532 euros, que es la más rentable de las opciones.
• Agua para PCR. El precio para 5 viales es de 208 euros, que es la más rentable de las opciones, teniendo en cuenta que es algo usado con una gran frecuencia en el laboratorio. 
• Termociclador. El precio es de 9.891,09 euros. 

Como se puede observar en el protocolo, se utiliza la Taq polimerasa, puesto que es de gran procesividad. 

    4.1.     PREPARACIÓN DE LOS CEBADORES.

Teniendo en cuenta que la concentración de cebadores debe ser de 0.5 µM y el volumen final deben ser 25 µl (es el tamaño del tubo de PCR, según el kit). Por tanto, debemos calcular la concentración de solución madre de cebadores: serán 12.5 pmol. 

Como hemos indicado anteriormente, la concentración de primers debe haber sido previamente cuantificada con Nanodrop.

Dichos 12.5 pmol deben ser añadidos a 1.25 µl y obtendremos una concentración de cebadores de 10 µM. 

Para preparar 10 µM de cebadores, tenemos que añadir 2.5 ml al tubo (ya que tenemos 25nmol de cebadores, según el protocolo). No obstante, en los tubos Eppendorf no cabe dicha cantidad, por lo que echaremos menos cantidad, pero más concentrada. Añadiremos 250µl, obteniendo así un tubo 10 veces más concentrado. Posteriormente, lo diluiremos añadiendo 10µl de cebadores a 90µl de tampón (dilución 1:10). Así, obtendríamos 10 tubos para que, si alguno se contamina, tengamos de sobra.  

    4.2.   EVITAR LA DEGRADACIÓN DEL DNA. 

Para evitar la degradación del DNA debemos añadir un buffer que, generalmente, será TE (Tris-EDTA). El tampón TE es utilizado por su eficacia para disolver el ADN y evitar su degradación. Además, tiene un papel importante en el lavado y aislamiento del ADN. Se utiliza en la extracción de ADN porque ayuda en la lisis de la pared celular y la membrana nuclear, manteniendo el pH óptimo de la disolución.

Una de las principales ventajas es que no presenta acetato, que es un inhibidor enzimático. Por lo general, usamos enzimas en el proceso de extracción de ADN y PCR, por lo que, si el acetato está presente, inhibirá estos procesos.

Asimismo, para comprobar que el DNA no se ha degradado, se realiza una electroforesis en gel de agarosa. Para ello, podemos seguir el procedimiento que sigue el vídeo que aparece a continuación:

    4.3.     OTRAS CONSIDERACIONES.   

Otros aspectos que debemos tener en cuenta es decidir el número de ciclos en función de la cantidad de DNA a amplificar. 

Asimismo, las puntas de las pipetas deben ser especiales y estar esterilizadas. Podemos usar pipetas de desplazamiento positivo, que cuestan 182.28 euros. 

Por último, se puede usar un gradiente de temperatura de los tubos en la primera reacción de PCR , para poder seleccionar aquella temperatura con la que se hayan obtenido mejores resultados.

Para tener más claro como llevar a cabo una PCR paso a paso, se muestra un vídeo a continuación:

5.    PURIFICACIÓN DEL DNA. 

El método más eficaz para separar fragmentos de DNA en función de su tamaño es la electroforesis en gel de agarosa. Asimismo, esta técnica permite aislar y cortar la zona de interés. En el apartado 4.2. aparece un vídeo de cómo llevar a cabo esta técnica.

Antes de hacerlo, debemos determinar el porcentaje de gel de agarosa a utilizar, según el tamaño del fragmento de DNA. Utilizaremos un porcentaje de 1.5% de agarosa para cada electroforesis porque cada fragmento se encuentra entre 200 y 3.000 pb. 

Además, para posteriormente purificar el DNA producto de la PCR utilizaremos un kit que vale 383 euros para 250 preparaciones, por lo que, cada preparación costaría 1.53 euros. Este kit viene con un protocolo, bastante fácil de seguir. 

Cuando se haya completado la electroforesis, los fragmentos de DNA son visibles como bandas bien definidas (al igual que aparece en la imagen de abajo). Hay que tener en cuenta que no veremos las bandas de los cebadores ya que son fragmentos muy pequeños. 

Además, también debemos comprar un marcador de bandas de DNA para saber cuál es mi banda en el gel. El precio sería de 68.75 euros un paquete de 5 unidades.

6.    SECUENCIACIÓN.

La secuenciación Sanger es una técnica de secuenciación de DNA en la que esta muestra es copiada muchas veces y se crean fragmentos de diferentes longitudes. Los nucleótidos fluorescentes terminan la cadena y permiten determinar la base. 

Este método tiene 2 principales limitaciones:

• Las primeras 25-30pb no se secuencian. 
• No copia más de unas 600-700pb. 

Para llevar a cabo esta secuenciación, se envía a la secuenciación de DNA a la Unidad de Genómica de la Universidad de Córdoba. Cuesta 4.75 euros. 

Para ello, debemos preparar 6 tubos:

• Tubo con CDS1 a secuenciar. Como se requieren 20ng por cada 100pb y tiene 187 pb, necesitaremos 2.99µl.
• Tubo con CDS1 a secuenciar. Como se requieren 20ng por cada 100pb y tiene 146 pb, necesitaremos 2.33µl.
• Cada primer serán 32nl en tubo de 0.2ml. En total debe haber 4 primers: 2 forward y 2 reverse.

7.     VALORACIÓN PERSONAL.

Bajo mi opinión, hacer un protocolo para llevar a cabo clonación del gen de la insulina es una tarea laboriosa, ya que hay que tener en cuenta muchos aspectos, a la vez que necesaria, pues, como alumnos, nos vemos capacitados de llevar a cabo un proceso poco conocido para nosotros, pero muy común en cualquier laboratorio. 

Para finalizar, me gustaría puntualizar que, para complementar este recurso, se pudiera llevar a cabo esta metodología en el laboratorio. 

8.     REFERENCIAS. 

NCBI - WWW Error Blocked Diagnostic. (s. f.-b). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH002844.2