CLONACIÓN Y SILENCIAMIENTO DEL GEN QUE CODIFICA LA POLIFENOL OXIDASA EN EL AGUACATE.
Por tanto, para evitar la aparición del color oscuro en el aguacate, el gen que codifica la polifenol oxidasa deberá ser silenciado.
El iRNA (interferencia de ARN) es un proceso celular natural que se utiliza para regular la expresión génica. Funciona mediante la degradación selectiva del ARN mensajero (ARNm), que es el intermediario que lleva la información genética del ADN al ribosoma para la síntesis de proteínas. La técnica del iRNA se utiliza para silenciar la expresión de un gen específico, de tal forma que la proteína que codifica no se sintetiza.
Existen varias formas de utilizar el iRNA para silenciar un gen. Una de las formas es mediante la técnica del ARN antisentido, también conocida como oligonucleótidos antisentido o ASO. Esta técnica consiste en sintetizar una secuencia corta de ARN complementaria a una secuencia específica del ARNm del gen de interés. La secuencia del ARN antisentido se une al ARNm complementario y forma una estructura de doble cadena que es reconocida por la ribonucleasa H, la cual degrada el ARNm.
Otra técnica para silenciar un gen mediante iRNA es el uso de ARN interferente (iRNA o siRNA). Los siRNA son moléculas de ARN de doble cadena de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud que son complementarias a la secuencia de ARNm del gen de interés. Los siRNA se unen al complejo RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) y desencadenan la degradación selectiva del ARNm del gen de interés.
Para clonar un gen y silenciarlo mediante la técnica del ARN antisentido o mediante el siRNA, se pueden seguir los siguientes pasos:
- Identificación del gen de interés: El primer paso es identificar el gen que se desea silenciar. Se pueden utilizar bases de datos como NCBI o Ensembl para buscar la secuencia de ADN del gen de interés.
- Diseño de la secuencia de ARN antisentido o siRNA: Una vez que se ha identificado la secuencia del gen de interés, se debe diseñar la secuencia de ARN antisentido o siRNA. Para el diseño del ARN antisentido, se debe sintetizar una secuencia corta de ARN complementaria a una secuencia específica del ARNm del gen de interés. Para el diseño del siRNA, se debe sintetizar una secuencia de ARN de doble cadena de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud, que sea específica para la secuencia de ARNm del gen de interés.
- Clonación del gen y la secuencia de ARN: Una vez que se han diseñado las secuencias de ARN antisentido o siRNA, se deben clonar en vectores de expresión adecuados. El protocolo de clonación puede variar según el sistema utilizado y se recomienda seguir las recomendaciones del fabricante de los reactivos y equipos utilizados.
- Transfección celular: Después de clonar el vector que contiene la secuencia de ARN antisentido o siRNA, se debe transfectar a las células que se deseen silenciar el gen de interés. El método de transfección celular utilizado puede variar según el tipo de células que se estén utilizando y el vector utilizado.
2. BÚSQUEDA DEL GEN QUE CODIFICA LA POLIFENOL OXIDASA DEL AGUACATE.
En primer lugar, vamos a buscar en NCBI el gen que codifica la polifenol oxidasa en el aguacate. Para ello, debemos utilizar la sección de búsqueda "Nucleotide". Sin embargo, observamos que no aparece ningún resultado de forma directa para este gen en el aguacate.
Por lo tanto, vamos a realizar una búsqueda indirecta: haremos uso del gen para la misma enzima de especies ya secuenciadas. Los genes ortólogos son genes homólogos de especies diferentes que evolucionaron a partir de un ancestro común en procesos de especiación.
En primer lugar, debemos realizar un análisis filogenético para encontrar la secuencia del DNA del aguacate, ya que los genes, generalmente, se encuentran muy conservados entre especies. Para sutilizar la búsqueda, seleccionaremos las plantas vasculares (Figura 1), ya que el aguacate está evolutivamente cercano a ellas.
Tras refinar la búsqueda hemos obtenido una serie de secuencias y, con ellas, crearemos una colección en nuestra cuenta de NCBI. Cabe destacar la importancia de tener en cuenta únicamente la región CDS, que comienza en el codón ATG y termina por un codón de terminación.
Posteriormente, tendremos una búsqueda más refinada, con un mucho menor número de secuencias. Dichas secuencias van a ser descargadas, en formato FASTA, y vamos a realizar un BLASTN en NCBI. Este alineamiento se hará comparando las secuencias que hemos descargado con una base de datos en la que se encuentre secuenciado el genoma del aguacate, como es Whole-genome shotgun contigs.
Tras obtener los resultamos, observamos secuencias que no se aproximan demasiado cortas y con poca homología que presentan, además, un E-value muy alto, por lo que su parecido podría ser debido al azar. Por tanto, debemos hacer una nueva búsqueda.
Como sabemos que el aguacate pertenece a la familia Lauraceae, vamos a buscar el gen de la polifenol oxidasa en dicha familia. El primer resultado que nos aparece es el genoma completo de Cinnamomum micranthum, por lo que debemos buscar en él el gen de la polifenol oxidasa.
En la Figura 2 podemos observar que se trata de un gen que presenta 3 exones. Vamos a obtener la secuencia FASTA del gen y llevaremos a cabo un BLASTN con la misma base de datos que antes y con el genoma de Persea americana. Los resultados obtenidos se muestran a continuación, en la Figura 3.
Tras realizar un nuevo Blast con Cinnamomun y Persea, se han encontrado 3 matches, como observamos en la Figura 4. Esto tiene sentido, ya que, como ya hemos visto, la secuencia presenta 3 exones.
Por lo tanto, podemos confirmar que hemos identificado el gen de la polifenol oxidasa en Persea americana. De este modo, ya podemos proceder a su clonación y a su posterior análisis y manipulación.
Tendremos que ordenar los exones para saber el orden del gen que la codifica. Como la base de datos nos indica que la hebra está en plus/minus.
El primer match, que es el más largo, va desde la base 16.394 hasta la base 17.404. El segundo match incluye desde la base 28.908 hasta la base 30.567. Por último, el tercer match incluye desde la base 14.658 hasta la base 15.327.
Por tanto, el primer exón será el tercer match, posteriormente será el match 1 y, por último, el match 2.
- Específica para el gen de interés: La secuencia de ARN de interferencia (siRNA) debe ser específica para el gen que se desea silenciar. Debe haber una coincidencia exacta entre la secuencia de la siRNA y la secuencia del gen de interés, para evitar efectos fuera del objetivo y minimizar la posibilidad de interferir con otros genes.
- Debe tener un diseño adecuado: El diseño de la siRNA es importante para asegurar que se produzca una inhibición eficiente del gen de interés. Se deben evitar secuencias de siRNA con estructuras secundarias o secuencias que puedan formar dímeros de siRNA, lo que podría reducir la eficacia del silenciamiento.
- Longitud adecuada: La longitud adecuada de la siRNA es de aproximadamente 21-23 nucleótidos. Esta longitud es suficiente para asegurar una alta especificidad y eficacia en la unión del ARN complementario y, por lo tanto, en el silenciamiento del gen.
- Debe dirigirse a una región conservada del gen: La siRNA debe estar dirigida a una región conservada del gen de interés, que sea esencial para la función del gen. De esta manera, se puede garantizar que el silenciamiento del gen tenga el efecto deseado.
4. SILENCIAMIENTO DEL GEN DE LA POLIFENOL OXIDASA EN EL AGUACATE.
El sistema de clonación Gateway es una técnica de clonación molecular que permite la transferencia eficiente y específica de una secuencia de ADN de interés desde un vector de clonación inicial a un vector de expresión final. El sistema utiliza una combinación de enzimas de restricción y recombinación homóloga, lo que facilita la clonación de genes en vectores de expresión y simplifica el proceso de construcción de vectores complejos.
Los principales pasos que vamos a seguir para silenciar el gen de la polifenol oxidasa en el aguacate se muestran a continuación:
- Obtener el gen de la polifenol oxidasa: Se debe extraer el gen de la polifenol oxidasa del aguacate. Ya lo hemos hecho.
- Diseñar los fragmentos de ARN pequeños (siRNA): Se deben diseñar los fragmentos de ARN pequeños que sean complementarios al ARN mensajero del gen de la polifenol oxidasa. Su función es unirse al ARNm de la polifenol oxidasa y degradarlo, lo que impide que se produzca la proteína.
- Construir el plásmido: Se debe construir un plásmido que contenga el gen de la polifenol oxidasa y los fragmentos de siRNA diseñados. El plásmido también debe contener un promotor específico para plantas, que permitirá que el plásmido se exprese en las células de la planta.
- Transformar las células de aguacate: El plásmido debe ser transformado en las células del aguacate. Esto se puede hacer mediante la técnica de la biobalística, que consiste en disparar partículas de oro o tungsteno recubiertas con el plásmido en las células de la planta.
- Regenerar la planta transgénica: Las células transformadas se cultivan en un medio de cultivo especializado para regenerar la planta completa. Esto implica seleccionar las células transformadas que han incorporado el plásmido y permitir que crezcan y se desarrollen para formar una planta completa.
- Validar la expresión de los fragmentos de siRNA: Se debe validar que los fragmentos de siRNA diseñados están siendo expresados por la planta transgénica. Esto se puede hacer mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR), que mide la cantidad de ARN expresado.
- Evaluar el silenciamiento del gen de la polifenol oxidasa: Se debe evaluar el silenciamiento del gen de la polifenol oxidasa en la planta transgénica. Esto se puede hacer mediante la medición de la actividad de la enzima polifenol oxidasa y la comparación con plantas no transgénicas.
5. AMPLIFICACIÓN DEL FRAGMENTO DE PERSEA AMERICANA.
La temperatura de fusión (Tm) del fragmento es de 81,7ºC. Por lo tanto, los primers deben tener una Tm entre 15-20ºC menos.
Dado que vamos a amplificar una región de 200 pb en la región 3'-UTR (923975-924175), necesitamos diseñar primers que se hibriden específicamente a esa secuencia y también introducir secuencias de restricción en el extremo 5'.
Utilizaremos las siguientes enzimas de restricción:
- Para el primer iniciador (forward), utilizaremos BamHI junto con 3 pb adicionales para lograr un rendimiento del 50-100%. La secuencia a añadir en el extremo 5' del primer sería: 5' NNNGGATCC 3'.
- Para el segundo iniciador (reverse), utilizaremos XhoI junto con 4 pb adicionales para lograr un rendimiento del 50-100%. La secuencia a añadir en el extremo 5' del primer sería: 5' NNNNCTCGAG 3'.
Se deben diseñar los fragmentos de ARN pequeños que sean complementarios al ARN mensajero (ARNm) del gen de la polifenol oxidasa. Estos fragmentos de ARN pequeños se denominan siRNA y su función es unirse al ARNm de la polifenol oxidasa y degradarlo, lo que impide que se produzca la proteína. Existen varias herramientas bioinformáticas que se pueden utilizar para el diseño de fragmentos de siRNA específicos para el gen de la polifenol oxidasa del aguacate.
Utilizando la herramienta online "siRNA Target Finder" y la secuencia del ARNm de la polifenol oxidasa del aguacate, se podrían diseñar los siguientes fragmentos de siRNA:
- Fragmento 1:
- Secuencia sentido: 5'-GGGAGCAGGCUACCUAUGU-3'
- Secuencia antisentido: 5'-ACAUAGGUAGCCUGCUCCT-3'
- Fragmento 2:
- Secuencia sentido: 5'-GGGAGCAGGCUACCUAUGU-3'
- Secuencia antisentido: 5'-ACAUAGGUAGCCUGCUCCT-3'
- 10 U/µL de enzima de alta frecuencia (XhoI HF y BamHI HF).
- 1 µg de ADN.
- rCutSmart Buffer 10X.
- Tubo Eppendorf.
- Añadir 1 µL de la enzima XhoI HF al tubo.
- Añadir 1 µg de ADN al tubo.
- Añadir 5 µL de rCutSmart Buffer 10X al tubo. Esto garantiza una concentración final de Buffer 1X, considerando que el volumen final será de 50 µL.
- Rellenar el tubo con agua libre de nucleasa hasta alcanzar un volumen final de 50 µL (44 µL de agua).
- Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 minutos con la enzima XhoI HF.
- Después de la incubación, inactivar la enzima XhoI HF sometiendo la muestra a 65 °C durante 20 minutos.
- Añadir 1 µL de la enzima BamHI HF al tubo.
- Incubar la mezcla a 37 °C durante 15 minutos con la enzima BamHI HF.
- Realizar una inactivación térmica a 65 °C durante unos minutos o realizar una extracción fenol/cloroformo para detener la reacción.
- Es importante recordar que tanto el vector como el fragmento de ADN deben seguir el mismo protocolo de restricción.
- Agua libre de nucleasas.
- Tubo de microcentrífuga.
- ADN inserto.
- Vector linearizado.
- Anza T4 DNA Ligasa Master Mix.
- Preparar una mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga utilizando los componentes adecuados según las instrucciones del kit.
- Mezclar los componentes de reacción y centrifugar brevemente el tubo.
- Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Para transformar bacterias competentes, utilizar de 1 a 5 µL de la mezcla de reacción.
- Almacenar la mezcla a 0-4 ºC según las instrucciones del kit utilizado.
8. TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS.
El vector recombinante se debe diseñar de manera que no contenga los genes CmR y ccdb, lo cual nos permitirá seleccionar las bacterias recombinantes utilizando un método de selección positiva con cloranfenicol y el producto de ccdb.
El procedimiento consiste en preparar una placa de agar que contenga cloranfenicol, lo cual permitirá el crecimiento de las bacterias transformadas recombinantes. Por otro lado, las bacterias no recombinantes no podrán crecer en esta placa, ya que ellas sintetizan el metabolito tóxico producido por la presencia del gen ccdb.
Para ello, utilizaremos el kit comercial "One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli" de Thermo Fisher Scientific. Además de eso, serán necesarios los siguientes materiales:
- Plásmido de interés linealizado o ADN a transformar.
- Agar LB (Luria-Bertani) con el antibiótico adecuado.
- Medio líquido LB con el antibiótico adecuado.
- Tubos de microcentrífuga estériles.
- Baño de hielo.
- Baño de agua a 42 °C.
- Espátula estéril.
- Pipetas y puntas estériles.
- Incubadora a 37 °C.
Los pasos serán los siguientes:
- Descongelar las células bacterianas competentes en hielo durante aproximadamente 5 minutos. Evitar descongelar y volver a congelar las células repetidamente para mantener su viabilidad.
- Añadir 1-5 µL del plásmido linealizado o ADN a transformar al tubo de microcentrífuga que contiene las células competentes. Mezclar suavemente por inversión del tubo varias veces para asegurar una distribución uniforme del ADN.
- Incubar en hielo durante 30 minutos para permitir que el ADN se incorpore a las células.
- Transferir el tubo a un baño de agua a 42 °C durante 30-45 segundos para realizar el choque térmico. Esto induce la entrada del ADN en las células.
- Retornar inmediatamente el tubo a un baño de hielo y dejarlo enfriar durante 2 minutos para estabilizar las células.
- Añadir 250 µL de medio líquido LB precalentado sin antibiótico al tubo. Incubar a 37 °C durante 1 hora con agitación suave (180-220 rpm) para permitir la recuperación de las células.
- Preparar placas de agar LB con el antibiótico correspondiente. También se pueden agregar otros suplementos selectivos según sea necesario.
- Transferir 50-100 µL de la suspensión bacteriana a las placas de agar utilizando una espátula estéril o una pipeta estéril. Distribuir uniformemente el líquido sobre la superficie del agar inclinando suavemente las placas.
- Incubar las placas en posición invertida a 37 °C durante aproximadamente 12-16 horas hasta que aparezcan colonias bacterianas visibles.
- Seleccionar colonias individuales y transferirlas a tubos de microcentrífuga conteniendo medio líquido LB con el antibiótico correspondiente.
- Incubar los tubos a 37 °C con agitación suave durante varias horas o durante la noche para permitir el crecimiento de las bacterias.
- Realizar una minipreparación de plásmidos para verificar la presencia y la integridad del ADN transformado utilizando un kit de extracción de plásmidos.
Además, debemos de purificar el vector recombinante, haciendo uso del kit comercial S.N.A.P Plasmid DNA MiniPrep Kit de Invitrogen, cuyo procedimiento está perfectamente detallado en su manual.
9. INTRODUCCIÓN EN OTRO VECTOR.
Para obtener la estructura de ARN interferente (ARNi), como se muestra en la Figura 6, se empleará el vector pK7GWIWG2(II) como plataforma de clonación. Este vector se utilizará como receptor de la secuencia de ARNi de interés. Para lograr la inserción de dicha secuencia en el vector, se empleará el sistema Gateway, que permite una transferencia específica y eficiente mediante la reacción de LR clonasa.
El sistema Gateway es una técnica de clonación molecular basada en la recombinación homóloga y el uso de enzimas de restricción. En este caso, se utilizará la reacción de LR clonasa, que es una reacción enzimática específica que facilita la inserción precisa y dirigida del fragmento de ARNi en el vector pK7GWIWG2(II). Esta reacción involucra la recombinación entre los sitios de reordenamiento específicos (attL y attR) presentes en el fragmento de ARNi y los sitios correspondientes en el vector. La enzima LR clonasa cataliza esta reacción de recombinación, permitiendo una transferencia eficiente y fiable del fragmento de ARNi al vector.
El vector pK7GWIWG2(II) es especialmente diseñado para la expresión de ARNi en diferentes sistemas biológicos, como plantas y otros organismos. Este vector contiene elementos clave, como promotores específicos para plantas, regiones de terminación, secuencias de clonación y otros elementos reguladores necesarios para la expresión adecuada del ARNi en el sistema de interés. Al introducir la secuencia de ARNi en este vector utilizando el sistema Gateway y la reacción de LR clonasa, se garantiza una correcta orientación y expresión del ARNi en el sistema de estudio.
9.1. REACCIÓN DE LA LR CLONASA.
Utilizaremos el kit "Gateway LR Clonase II Enzyme mix" de Invitrogen para realizar la reacción de la LR clonasa. Los materiales necesarios serán:
- Kit Gateway LR Clonase II Enzyme mix (Invitrogen).
- Vector de clonación que contiene los sitios de reordenamiento específicos (attR) para la reacción de LR clonasa.
- Fragmento de ADN de interés que contiene los sitios de reordenamiento específicos (attL) para la reacción de LR clonasa.
- Agua libre de nucleasas.
- Tubos de reacción.
- Termociclador o equipo de termociclado.
Los pasos que se llevarán a cabo son:
- Añadir los componentes proporcionados en las instrucciones del kit a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a temperatura ambiente. Mezclar cuidadosamente.
- Descongelar en hielo la mezcla de LR clonasa durante 2 minutos.
- Hacer vórtex enérgicamente la mezcla de LR clonasa durante unos segundos para asegurar una distribución homogénea.
- Añadir 4 µL de la mezcla de LR clonasa a cada muestra preparada en el paso 1. Mezclar bien haciendo vórtex brevemente 2 veces durante 2 segundos en cada ocasión.
- Incubar las mezclas de reacción a 25ºC durante 1 hora.
- Añadir 2 µL de solución de Proteinasa K a cada reacción e incubar durante 10 minutos a 37 ºC para inactivar la enzima LR clonasa y degradar las proteínas presentes.
- Realizar la transformación y selección de bacterias competentes según el proceso descrito en el apartado 5.3 del kit . La reacción de la LR clonasa elimina el gen ccdb del vector de destino, permitiendo la supervivencia de las bacterias transformadas.
- Realizar la extracción del plásmido de destino utilizando el kit empleado e. Este paso permitirá aislar y purificar el plásmido recombinante para su posterior análisis o aplicación en experimentos posteriores.
10. TRANSFORMACIÓN DE LAS CÉLULAS DE AGUACATE.
Para realizar la transformación de las células de aguacate utilizando la técnica de la biobalística necesitamos los siguientes materiales:
- Células de aguacate en cultivo de tejidos
- Plásmido de clonación que contiene el gen de interés y el promotor
- Balística de partículas (por ejemplo, la Biolistic PDS-1000/He, de Bio-Rad)
- Cartuchos de disparo de 0,6 micras (por ejemplo, los cartuchos de oro de Bio-Rad).
- Tubos de colección.
- Solución de tampón de lavado (por ejemplo, PBS).
- Agar selectivo.
- Cañón de biobalística.
- Equipo de cultivo celular.
- Medio de cultivo adecuado para las células de aguacate.
- Incubadora de cultivo celular.
El procedimiento a llevar a cabo será:
- Preparación de las células de aguacate: cultivar las células de aguacate en un medio de cultivo adecuado en una incubadora de cultivo celular. Las células deben estar en una fase de crecimiento exponencial, con un porcentaje de viabilidad del 80% o superior.
- Preparación del plásmido y las partículas: Preparar el plásmido que contiene el fragmento de siRNA y el promotor específico para plantas utilizando el kit Gateway.
- Recubrir las partículas de oro o tungsteno con el plásmido según las instrucciones del fabricante.
- Cargando el cañón de biobalística: Colocar las partículas recubiertas con el plásmido en el soporte del cañón de biobalística.
- Disparo de las partículas: Colocar las células de aguacate en un soporte de cultivo adecuado y posicionarlo en el cañón de biobalística.
- Cultivo de las células transformadas: Después del disparo, transferir las células a un medio de cultivo fresco y colocarlas en la incubadora de cultivo celular.
- Cultivar las células a una temperatura y condiciones adecuadas para las células de aguacate.
- Selección de células transformadas: ponemos en el medio con el antibiótico y, las que sobrevivan, serán las que son recombinantes.
- Si el plásmido incluye un marcador de selección, añadir el agente de selección adecuado al medio de cultivo.
- Análisis de la expresión del gen: extraer el ARN de las células transformadas y realizar una PCR cuantitativa para analizar la expresión del gen de la polifenol oxidasa y verificar el silenciamiento del mismo.
10.1. REGENERACIÓN DE LA PLANTA TRANSGÉNICA.
La regeneración de la planta transgénica se realiza para permitir que las células transformadas, que han incorporado el plásmido que contiene el gen de interés y el promotor, se desarrollen en una planta completa y funcional. Esto implica seleccionar y cultiva las células transformadas en un medio de cultivo especializado que contenga los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. Una vez que las células han crecido lo suficiente, se pueden trasplantar a un sustrato adecuado para su crecimiento y maduración. La regeneración de la planta transgénica es un paso importante en la obtención de plantas que expresen el gen de interés de manera estable y hereditaria.
Los materiales utilizados serán:
- Placas de Petri con medio de cultivo MS
- Agar
- Hormonas de crecimiento (por ejemplo, BAP y NAA)
- Células transformadas de aguacate
- Microscopio estereoscópico
- Jeringas estériles
- Bolsas de plástico transparente
El procedimiento será el siguiente:
- Preparar las placas de Petri con medio de cultivo MS y agregar agar para solidificar el medio.
- Agregar hormonas de crecimiento, como BAP y NAA, al medio de cultivo. La concentración específica dependerá del tipo de células y la especie de planta.
- Transferir las células transformadas de aguacate al medio de cultivo y sellar las placas de Petri con cinta adhesiva o parafilm.
- Colocar las placas de Petri en un lugar oscuro y cálido (25-28°C) para la germinación.
- Observar las placas diariamente con un microscopio estereoscópico para detectar cualquier signo de germinación.
- Una vez que las plántulas han brotado, transferirlas a bolsas de plástico transparente para mantener la humedad y promover el crecimiento. Hacer pequeñas aberturas en las bolsas para permitir la ventilación.
- Continuar cultivando las plántulas en un medio de cultivo especializado, cambiando el medio según sea necesario y monitoreando el crecimiento y la salud de las plantas.
10.2. VALIDACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS FRAGMENTOS MEDIANTE RT-PCR.
Se puede realizar una extracción de ARN total de la planta de aguacate transformada y luego llevar a cabo una retrotranscripción para obtener ADNc. Posteriormente, se puede amplificar el fragmento del gen de la polifenol oxidasa mediante PCR y analizar la cantidad de producto obtenido en gel de agarosa. Si la intensidad de la banda obtenida es menor en la planta transformada en comparación con la planta no transformada, se podría concluir que se ha logrado silenciar el gen. A continuación, se muestran los pasos a seguir para llevar a cabo el proceso:
- Aislamiento de ARN total: Se extrae el ARN total de la muestra utilizando un kit comercial. Es importante trabajar en condiciones asépticas para evitar la contaminación.
- Síntesis de cDNA: La transcriptasa inversa se utiliza para sintetizar cDNA a partir del ARN total. Los cebadores oligo-dT o cebadores específicos del gen de interés se utilizan para iniciar la síntesis de cDNA y los elegidos en este caso se muestran a continuación:
- Oligo-dT: 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
- Cebador: 5'-GTGGAGGTTTTCCCAGTCAC-3'.
- Amplificación de cDNA mediante PCR: Los cebadores específicos del gen de interés se utilizan para amplificar el cDNA mediante la técnica de PCR. La amplificación se lleva a cabo durante varios ciclos de temperatura, incluyendo la desnaturalización del ADN a alta temperatura, la hibridación de los cebadores a la temperatura adecuada y la extensión de los cebadores por la polimerasa a la temperatura adecuada.
- Análisis de los productos de PCR: Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa. La presencia y la intensidad de la banda de PCR se correlacionan con los niveles de expresión del gen de interés.
- Análisis cuantitativo de la expresión génica: La técnica de PCR en tiempo real (qPCR) permite una mayor precisión en la medición de los niveles de expresión génica. Se utilizan cebadores específicos del gen de interés y una sonda fluorescente para medir la cantidad de producto de PCR en tiempo real.
Es importante tener en cuenta que se deben incluir controles positivos y negativos en cada paso del proceso para garantizar la calidad y la precisión de los resultados. El uso de la técnica de qPCR permite una mayor precisión en la medición de los niveles de expresión génica.
10.3. EVALUACIÓN DEL SILENCIAMIENTO DEL GEN DE LA POLIFENOL OXIDASA.
Para evaluar el silenciamiento del gen de la polifenol oxidasa necesitamos:
- Plantas transgénicas y no transgénicas de aguacate.
- Extracto de proteína de las hojas de las plantas.
- Solución tampón de extracción de proteína (por ejemplo, PBS).
- Reactivos para la medición de la actividad de la enzima polifenol oxidasa (por ejemplo, ácido clorhídrico, catecol, solución tampón de fosfato, etc.).
El procedimiento a seguir será:
- Preparar las muestras de hojas de las plantas transgénicas y no transgénicas de aguacate. Tomar aproximadamente 0,5 gramos de hojas frescas y homogeneizarlas en solución tampón de extracción de proteína.
- Centrifugar la mezcla a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Recolectar el sobrenadante y medir la concentración de proteína con un kit de ensayo de proteínas (por ejemplo, kit de ensayo de proteínas BCA).
- Preparar una solución de ácido clorhídrico 0,1 M y una solución de catecol 0,2 M en solución tampón de fosfato.
- Mezclar 10 μl de extracto de proteína (aproximadamente 30 μg de proteína total) con 90 μl de solución tampón de fosfato en una placa de 96 pocillos. Preparar al menos tres réplicas por cada muestra.
- Agregar 100 μl de solución de catecol 0,2 M en la placa y mezclar bien.
- Medir la absorbancia a 420 nm cada minuto durante 10 minutos utilizando un espectrofotómetro.
- Calcular la tasa de oxidación de catecol en función de la absorbancia medida en cada tiempo.
- Comparar la actividad de la enzima polifenol oxidasa entre las plantas transgénicas y no transgénicas de aguacate.
11. VALORACIÓN PERSONAL.
Esta práctica me ha resultado algo compleja, aunque ha servido para ver desde otro punto de vista cómo seríamos capaces de llevar a cabo algo tan sumamente complejo.
Asimismo, me parece que es bastante completa, ya que hemos vuelto a realizar la búsqueda de genes, el diseño de primers, búsquedas bibliográficas e incluso búsquedas de protocolos de laboratorio.
Por último, me gustaría decir que la técnica de iRNA es una herramienta muy poderosa en la investigación científica y ha tenido un impacto significativo en la comprensión de la función de los genes en diferentes organismos. Aunque se deben tener en cuenta algunos desafíos y limitaciones al aplicar esta técnica, el iRNA sigue siendo una técnica valiosa para el estudio de la Biología Molecular y el desarrollo de terapias génicas en el futuro.
12. BIBLIOGRAFÍA.
- New England Biolabs. (s. f.). Cleavage Close to the End of DNA Fragments | NEB. https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2015). Molecular biology of the cell (6th ed.). Garland Science.
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. (Eds.). (2007). Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons.
- Thermo Fisher Scientific. (2018). Gateway Cloning Technology. https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/gateway-cloning-technology.html
- U.S. National Library of Medicine. (2021). BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
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